L’extraction des acides nucléiques est la première étape du protocole de préparation des échantillons NGS. Les acides nucléiques sont de grosses biomolécules essentielles à toutes les formes de vie connues. Ils sont composés de nucléotides, des monomères constitués de trois éléments : un sucre, un phosphate et une base azotée. Les deux principales classes d’acides nucléiques sont l’ADN et l’ARN. Le sucre de l’ARN est le ribose, tandis que celui de l’ADN est le désoxyribose.
Schéma illustrant la structure de l’ARN (à gauche) et de l’ADN (à droite). L’uracile est la base appariée à l’adénine dans l’ARN, tandis que la thymine est appariée à l’adénine dans l’ADN. Crédit image : Wikipédia
Types d’extraction d’acide nucléique
Extraction au thiocyanate de guanidinium, au phénol et au chloroforme
Une fois la structure cellulaire de l’acide nucléique perturbée, la DNase et la RNase sont utilisées pour inactiver les nucléases cellulaires. Les acides nucléiques souhaités peuvent alors être séparés des débris cellulaires.
Le phénol seul est un acide carbolique inflammable, corrosif et toxique. Cependant, un mélange de phénol, de chloroforme et d’une petite quantité d’isoamyle peut être utilisé pour extraire l’ADN. Lorsque le phénol et le chloroforme sont ajoutés à l’échantillon, une émulsion se forme, contenant une couche d’ADN à la surface, grâce à sa nature hydrophile. L’ADN peut ensuite être recueilli et précipité par centrifugation. Le culot d’ADN obtenu peut ensuite être dissous dans de l’eau stérile.
Schéma illustrant les étapes de l’extraction au phénol-chloroforme : ajout du mélange phénol-chloroforme au lysat cellulaire, centrifugation, puis lavage à l’eau pour obtenir l’ADN isolé. Crédit image : Eva Meszaros, 2021
La technique thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme permet ensuite d’extraire l’ARN en une seule étape. Après extraction, l’ARN est séparé de l’ADN à l’aide d’une solution acide composée de thiocyanate de guanidinium, d’acétate de sodium, de phénol et de chloroforme. La récupération de l’ARN se fait par précipitation à l’isopropanol, ce qui crée un milieu acide permettant à l’ARN de rester en surface.
Centrifugation en gradient de chlorure de césium et de bromure d’éthidium
La centrifugation en gradient de chlorure de césium / bromure d’éthidium est utilisée dans les laboratoires de recherche depuis 1950. La méthode exploite les densités différentes entre les ions césium et l’eau, ainsi que l’intercalation du bromure d’éthidium pour interférer avec la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison de l’ADN.
Cette centrifugation en gradient est une méthode complexe, coûteuse et longue comparée aux autres protocoles d’isolement. Elle nécessite une grande quantité d’échantillon et ne convient donc pas à tous les types de séquençage. De plus, le bromure d’éthidium est nocif. Par conséquent, cette méthode n’est pas utilisée en laboratoire clinique en raison de ses limites.
Extraction en phase solide
La purification nucléique en phase solide est présente dans la plupart des kits d’extraction commerciaux disponibles sur le marché. Elle est généralement réalisée à l’aide d’une colonne centrifuge fonctionnant sous force centrifuge, ce qui permet une purification rapide et efficace de l’ADN. La colonne doit d’abord être conditionnée pour l’absorption de l’échantillon, ce qui peut être réalisé à l’aide d’un tampon à un pH donné. Une fois les cellules désintégrées, les acides nucléiques souhaités sont absorbés par la colonne grâce au pH de la solution de liaison. Les contaminants sont ensuite éliminés par lavage avec un agent compétitif, puis de l’eau est introduite pour libérer les acides nucléiques souhaités de la colonne.
Purification à base de billes magnétiques
La séparation magnétique est désormais considérée comme une méthode simple et efficace pour la purification des acides nucléiques. Il s’agit d’une variante de l’extraction en phase solide. Les billes présentent une charge de surface négative et se lient sélectivement aux protéines, comme l’ADN. Le processus de liaison peut parfois être facilité par l’application d’un aimant sur la paroi du tube, ce qui agrège les particules près de la paroi. Le reste de l’échantillon, composé de débris cellulaires et de matières indésirables, peut ensuite être éliminé. Les acides nucléiques sont séparés des particules magnétiques à l’aide d’un tampon et les contaminants restants sont éliminés par lavage.
Schéma illustrant le protocole de purification par billes magnétiques. Crédit image : Andrew Gane, 2019
Cette méthode présente des avantages indéniables : elle ne nécessite pas de centrifugation répétée, de filtration sous vide ni de séparation sur colonne, ce qui la rend rapide et économique. De nombreux kits commerciaux sont disponibles, certains fabricants associant même des billes magnétiques à d’autres techniques d’extraction en phase solide, notamment l’utilisation de silice. Ces technologies aident les scientifiques en améliorant la récupération d’ADN avec de faibles volumes d’échantillon.
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